结直肠癌（Colorectal Cancer体育游戏app平台，CRC）是一种发源于结肠或直肠的癌症，频繁始于良性息肉，并逐步演变为恶性肿瘤。它具有高度的遗传异质性，触及多种基因突变（如APC、KRAS、TP53等），这些突变共同促进了肿瘤的发展和扩散。值得精通的是，CRC并不是单一类型，而是不错把柄基因抒发的不同模式（即基因抒发谱）进一步细分为多个分子亚型。每个亚型皆有其独有的基因变异和抒发特征，这导致它们在生物学行径、疾病推崇以及对治愈的反应方面存在权臣互异。尽管当今轮廓性治愈可使晚期患者的中位总生计期达到30个月，但举座物化率依旧较高。为了更好地相连各分子亚型的特色并开发更有用的治愈计谋，扣问东说念主员驾御从患者手术切除的原发性CRC组织构建类器官模子，以模拟体内环境，进行高通量药物筛选来识别针对特定亚型的有用疗法。

小恒本期则主要整理CRC类器官的构建步履，供全球学习参考。

CRC是由大肠内名义上皮细胞的恶性震荡引起，培养的CRC类器官施行即是癌变的肠上皮组织，与泛泛结肠类器官的培养神志通常。另外，针对泛泛结肠组织类器官的培养基只需稍加修改即可适用于CRC类器官的扩增（表1）[1]。与泛泛结肠类器官不同的是，额外94%的CRC病例中WNT/β-catenin已被握续性激活，因此Wnt3A条目培养基对于CRC类器官来说不是必要的，况兼WNT信号的缺失有助于扼制泛泛组织在CRC类器官培养基中滋长。

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表1. 东说念主和小鼠类器官培养基要素对比[1]

基于文件整理的CRC类器官的构建步履：

图1. CRC类器官构建步履暗意图[2]

1. 实验前准备

主要试剂及仪器开荒：生物安全柜，组织培养箱，离神思，细胞计数仪，显微镜，Matrigel，癌症干细胞（CSC）培养基，肿瘤解离液。

2. 组织赢得与处置

（1）样本赢得：从手术切除的未接受过治愈的CRC患者组织中赢得样本，需患者知情得意及关连伦理委员会批准。将崭新的原发性结直肠癌样本保存在预冷的PBS中，幸免冷冻。

（2）清洗组织：在超净使命台中，将肿瘤组织转化至含有PBS的培养皿中，清洗2 - 3次，以去除血液和杂质。随后用CSC培养基再次清洗组织。

（3）剪碎组织：使用镊子和剪刀将肿瘤组织剪碎成约2mm大小的碎屑，尽量保证碎屑大小均匀，以加多细胞解离的效果。

（4）消化组织：将剪碎的肿瘤组织转化至肿瘤解离液中，于37°C孵育1h。技巧每隔15min，通过动荡或无菌吸管高下奏乐10-15次，以促进消化。

（5）过滤汇注：消化后的组织悬液经70μm细胞筛过滤，再用1-2mL CSC培养基冲洗滤网，确保细胞充分汇注。随后在4°C下450g离心5min，汇注细胞千里淀。

3. 细胞分辨与富集

（1）红细胞裂解：向细胞千里淀中加入5mL含0.8%（w/v）氯化铵和0.1 mM EDTA的溶液，冰上孵育10min，裂解红细胞。若红细胞裂解不统统，可适合加多氯化铵溶液体积并蔓延孵育时刻。

（2）去除死细胞：加入等体积的CSC培养基，在4°C下450g离心5min，弃上清。通过死细胞去除试剂盒，按照制造商的决策去除死细胞，得到活细胞悬液。

（3）细胞分选与培养：可通过流式细胞分选（FACS）富集CD133+肿瘤肇端细胞。将CD133+ 肿瘤细胞重悬于CSC培养基并计数，以5×10⁴ cells/mL的密度接种于非黏附培养瓶中，37°C、5% CO₂培养2周，直至出现多细胞聚会体（类器官球）。

4. 类器官培养与保管

（1）类器官球培养：类器官球培养技巧，每3天更换一次CSC培养基。每周进行一次传代，若类器官球滋长过快，需提前传代。传代时，可选择机械奏乐或酶解的步履将类器官球解离成单细胞悬液。

（2）类器官培养：

① 单细胞悬液制备：将类器官球机械解离成单细胞悬液，进行细胞计数。若实验触及病毒载体转导操作，需在此才调前进行。

② Matrigel与细胞搀和及铺板：以6孔板为例，将细胞稀释至合适浓度，与预冷的Matrigel按1:1比例搀和均匀，快速吸取300μL搀和液，滴加至6孔板的每个孔中心，留意操作幸免产不满泡，使Matrigel团员酿成穹顶结构。

③ 类器官酿成：向每个孔中冷静加入3mL CSC培养基，幸免冲散穹顶结构。将培养板放回培养箱不时培养，1-2周后可不雅察到类器官。

④ 类器官保管：依期不雅察类器官的滋长情况，把柄培养基表情变化和类器官滋长景色，每2-3天更换一次培养基。当类器官滋长至合适大小或需要进行实验时，可进行后续操作，如药物处置、基因裁剪等。若需长期保存类器官，可将其冻存于液氮中，冻存液为含10% DMSO、30% KnockOut Serum Replacement 和 60% CSC培养基的搀和液。

5. CRC类器官镜下方法图

图2. 结直肠癌类器官球[2]

图3. 原发性肿瘤过头繁衍的肿瘤类器官的H&E染色[3]

本期对于结直肠癌类器官的构建步履就先容已矣，更多的细节全球不错再把柄我方的实验诡计来进一步完善。下期咱们将不时先容更多类器官的内容，敬请关心小恒学术~

参考文件

[1] Barbáchano A, Fernández-Barral A, Bustamante-Madrid P, Prieto I, Rodríguez-Salas N, Larriba MJ, Muñoz A. Organoids and Colorectal Cancer. Cancers (Basel). 2021 May 28;13(11):2657.

[2] Bergin CJ, Benoit YD. Protocol for serial organoid formation assay using primary colorectal cancer tissues to evaluate cancer stem cell activity. STAR Protoc. 2022 Mar 4;3(1):101218.

[3] van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Bounova G, Iorio F, Pronk A, van Houdt W, van Gorp J, Taylor-Weiner A, Kester L, McLaren-Douglas A, Blokker J, Jaksani S, Bartfeld S, Volckman R, van Sluis P, Li VS, Seepo S, Sekhar Pedamallu C, Cibulskis K体育游戏app平台, Carter SL, McKenna A, Lawrence MS, Lichtenstein L, Stewart C, Koster J, Versteeg R, van Oudenaarden A, Saez-Rodriguez J, Vries RG, Getz G, Wessels L, Stratton MR, McDermott U, Meyerson M, Garnett MJ, Clevers H. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 2015 May 7;161(4):933-45.

发布于：湖南省